Ферменты доказательства белковой природы ферментов

2. Ферменты

Ферменты, или энзимы — вещества белковой природы, обладающие каталитической активностью. Термин «энзим» — от греч. en zyme- в дрожжах, «фермент» — от лат. fermentatio — брожение.

Учение о ферментах выделено в самостоятельную науку энзимологию.

Хотя уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов — рибонуклеазы, лизоцима, единственный способ получения ферментов — это выделение их из биологических объектов.

2.1. Химическая природа ферментов

Доказательства белковой природы ферментов:

1. Ферменты при гидролизе распадаются на аминокислоты.

2. Под действием кипячения и др. факторов ферменты подвергаются денатурации и теряют каталитическую активность.

3. Осуществлено выделение ферментов в форме кристаллов белка.

4. Ферменты оказывают высокоспецифическое действие.

Прямым доказательством белковой природы ферментов является лабораторный синтез первого фермента – рибонуклеазы.

Выделяют простые ферменты, состоящие только из полипептидной цепи: пепсин, трипсин, уреаза, рибонуклеаза, фосфатаза и др.

Большинство природных ферментов — сложные белки. Их небелковые компоненты называются кофакторами и необходимы для выполнения ферментом его каталитической роли. Кофакторами ферментов являются витамины или соединения, построенные с их участием (коэнзим А, НАД + , ФАД); фосфорные эфиры некоторых моносахаридов, ионы металов.

Кофермент — небелковый фактор, который легко отделяется от белковой части — апофермента при диссоциации.

Простетическая группа – ковалентно связанный с белковой цепью небелковый компонент, который не отделяется при выделении и очистке фермента.

Весь фермент вместе с простетической группой назыывают холоферментом. Только объединение апофермента и кофермента обеспечивает активность холофермента.

Субстрат – вещество, подвергающееся превращениям под действием фермента.

Активный центр — специфический участок на поверхности фермента, связывающийся с молекулой субстрата и непосредственно участвующий в катализе. Активные центры ферментов образуются на уровне третичной структуры. У сложных ферментов в состав активного центра входят также простетические группы. Кофакторы ферментов выполняют роль промежуточных переносчиков атомов или групп.

В активном центре различают два участка. Субстратный (связывающий) центр — участок, отвечающий за присоединение субстрата. Его называют контактной, или «якорной» площадкой фермента. Каталитический центр отвечает за химическое превращение субстрата. В состав каталитического центра большинства ферментов входят такие аминокислоты, как серин, цистеин, гистидин, тирозин, лизин. Субстратный центр может совпадать (или перекрываться) с каталитическим центром.

Аллостерический центр — участок молекулы фермента вне его активного центра, который способен связываться с тем или иным веществом (лигандом). В результате изменяется третичная, а часто и четвертичная структура белковой молекулы. Как следствие изменяется конфигурация активного центра и каталитическая активность фермента. Это т. н. аллостерическая регуляция активности ферментов. Ферменты, активность каталитического центра которых подвергается изменению под влиянием аллостерических эффекторов, называют аллостерическими.

Некоторые из ферментов являются полифункциональными, т. е. обладают несколькими энзиматическими активностями, но всего лишь одной полипептидной цепью. Их белковая цепь образует несколько доменов, каждый из которых характеризуется своей каталитической активностью. Например, алкогольдегидрогеназа не только катализирует реакцию окисления спиртов, но также реакции обезвреживания ряда ксенобиотиков.

Изоферменты — это множественные формы фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся друг от друга по физическим и химическим свойствам — сродству к субстрату, активности, электрофоретической подвижности.

Например, фермент лактатдегидрогеназа катализирует обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Она состоит из 4 субъединиц и содержит два типа полипептидных цепей: Н- сердечный тип (от англ. heart- сердце) и М — мышечный тип (от англ. muscle- мышца). Этот фермент благодаря различным сочетаниям субъединиц может существовать в 5 формах:

Для каждой ткани в норме характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ. Например, в сердечной мышце преобладает Н₄, т.е. ЛДГ₁, а в скелетных мышцах и печени – М₄ (ЛДГ₅). Изучение появления изоферментов ЛДГ в сыворотке крови позволяет судить о месте патологического процесса и о степени поражения органа или ткани.

Особую группу ферментов составляют мультимолекулярные ферментные комплексы. Существование таких комплексов ускоряет химические превращения. Если мультиэнзимный комплекс обслуживает единый, многоступенчатый процесс биохимических превращений, его называют метаболоном. Таковы метаболоны гликолиза, цикла Кребса, дыхательная цепь митохондрий и др.

Источник

История энзимологии (прод.)

В 1878 г. Манассеина получила бесклеточный препарат дрожжей, перетирая их в ступке со стеклянным порошком. Этот экстракт был способен получать этанол, что утвердило мнение Либиха. В 1897 году Э. Бюхнер повторил этот эксперимент, получив свободный от клеток экстракт из дрожжей, разрушая их вакуумированием.

История энзимологии (прод.)

В 1894 году Э. Фишер предложил модель взаимодействия фермента и субстрата, названной «ключ-замок». В 1926 году Дж. Самнер после почти 9-летених исследований доказал белковую природу фермента уреазы. Вскоре Дж Нортроп и М Кунитц указали на прямую корреляцию между активностью кристаллических пепсина, трипсина и количеством белка в исследуемых образцах, приведя тем самым весомые доказательства белковой природы ферментов. 1955 г. – С. Мур и У. Стейн расшифровали структуру рибонуклеазы (124 АК остатка).

История энзимологии (прод.)

В 1963 году исследована аминокислотная последовательность РНКазы из поджелудочной железы. В 1965 г показана пространственная структура лизоцима . 1969 г. – синтез рибонуклеазы в лаборатории Б. Меррифилда в Нью-Йорке. За последующие годы очищены тысячи ферментов и получены новые данные о механизмах действия ферментов, их пространственной структуре, регуляции ферментативных реакций. Обнаружена каталитическая активность у РНК ( рибозимы ). Получены антитела с ферментативной активностью – абзимы .

Доказательства белковой природы ферментов

Все ферменты действуют в мягких условиях : const t°, const рН, const ионная сила, оптимальное соотношение субстратов, продуктов, модуляторов. Все ферменты являются высокомолекулярными соединениями (ВМС), с молекулярной массой от неск. тысяч до неск. миллионов дальтон (1 дальтон = массе одного атома водорода), в связи с чем, образуют коллоидные растворы , которые обладают буферными свойствами , вязкостью, дают опалесценцию, образуют конус Тиндаля . Способны к денатурации под действием тех же факторов, которые вызывают денатурацию белка. При необратимой денатурации ферменты полностью инактивируются. При гидролизе распадаются на аминокислоты . Обладают « эффектом защиты » (связывают воду, ионы тяжелых металлов).

Доказательства белковой природы ферментов (прод.)

Ферменты как и белки обладают антигенной активностью и при парэнтеральном введении стимулируют образование антител. Обладают электрофоретической подвижностью и амфотерными свойствами . Не способны к диализу через полупроницаемые мембраны. Легко осаждаются из водных растворов методом высаливания . Обладает высокой специфичностью действия. Лабораторный синтез фермента рибонуклеазы , доказывает его белковую природу (в лаборатории Мерифилда в 1969 году).

Особенности ферментативного катализа

Исключительно высокая эффективность. Эффективность биологического катализа превышает эффективность неорганического в 10 9 – 10 12 раз. Специфичность: Абсолютная специфичность , когда фермент работает только со своим субстратом ( фумараза с транс-изомерами фумаровой кислоты и не будет с цис-изомерами); Групповая — специфичен для узкой группы родственнных субстратов (ферменты ЖКТ). Ферменты «работают» в мягких условиях (t=37°C, рН 7,0, определенные осмолярность и солевой состав). Многоуровневая регуляция : регуляция активности на уровне условий среды , на уровне метаболона , на генетическом уровне, тканевом, клеточном , с помощью гормонов и медиаторов , а также с помощью субстратов и продуктов той реакции, которую они катализируют.

Особенности ферментативного катализа (прод.)

Кооперативность: ферменты способны организовывать ассоциации — продукт 1-го фермента, является субстратом для 2-го; продукт 2-го — субстратом для 3-го и т.д. Ферменты обладают адаптивностью , т. е. могут изменять свою активность и образовывать новые ассоциации. Способны катализировать как прямую так и обратную реакцию . Направление реакции для многих ферментов определяется соотношением действующих масс. Катализ жестко расписан, т. е. происходит поэтапно . Если какое-либо соединение существует в форме цис- и трансизомеров, то для каждой из этих форм, существует свой фермент. Например, фумараза катализирует превращение только фумаровой кислоты (транс-), но не действует на цис-изомер — малеиновую кислоту.

Строение ферментов

Ферменты как и белки делятся на две группы: простые и сложные. Простые полностью и целиком состоят из а/к и при гидролизе образуют исключительно а/к. Сложные ферменты кроме белковой части ( апофермента ) содержат и небелковый компонент ( кофактор ). Кофакторы различаются по прочности связывания с апоферментом.

Кофакторы

Если константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе все ПП цепи оказываются связанными со своими небелковыми компонентами и не разделяются при выделении и очистке, то небелковый компонент называется простетической группой и рассматривается как интегральная часть молекулы фермента. Под коферментом понимают дополнительную группу, легко отделяемую от апофермента, при диссоциации.

Примеры коферментов

Между апоферментом и коферментом существуют нековалентные связи (водородные или электростатического взаимодействия). Типичными представителями коферментов являются: Тиаминпирофосфат , ТПФ (производное витамина В 1 , тиамин) – кофермент пируватдегидрогеназного и альфа- кетоглутаратдегидрогеназного комплексов; ФАД, ФМН (производные витамина В 2 , рибофлавин) – коферменты ряда дегидрогеназ, напр. сукцинатдегидрогеназы; НАД, НАДФ (производные витамина РР, ниацин) коферменты ряда дегидрогеназ, напр. лактатдегидрогеназы; Пиридоксальфосфат (производное витамина В 6 , пиридоксин) – кофермент трансаминаз, напр. аспартатаминотрансфераза (АсАТ), аланинаминотрансфераза (АлАТ); коэнзим А (производное пантотеновой кислоты) – кофермент ацилирования.

Источник

Структура и общие свойства ферментов

Энзимология – наука о ферментах

Фермент – биологический катализатор белковой природы. Энзимология появилась на стыке химической, биологической и медицинской наук.

Значение ферментов

любые химические превращения веществ в организме происходят при участии ферментов, практическое применение ферментов во всех областях деятельности, где речь идёт о живых существах: • хлебопечение, • виноделие, • сыроварение, • чайное, кожевенное, меховое производство.

Значение ферментов

Инженерная энзимология

Иммобилизованная β-галактозидаза, присоединённая к магнитному стержню-мешалке, используется для снижения содержания молочного сахара в молоке, то есть продукта, который не расщепляется в организме больного ребёнка с наследственной непереносимостью лактозы. Методами генной инженерии получены L-треонин, витамин В 12 , интерфероны.

История развития энзимологии

Появилась энзимология в 1814 году, когда Кирхгоф показал, что в вытяжке из проросшего ячменя содержится вещество, которое вызывает превращение крахмала в сахар (амилаза). В 1836 году Т.Шванн выделил из желудочного сока пепсин. В настоящее время известно 10 000 ферментов, 500 получено в кристаллическом

Доказательства белковой природы ферментов

все выделенные ферменты – белки, методы получение ферментов и белков одинаковы, факторы, вызывающие денатурацию белка, вызывают инактивацию ферментов, при гидролизе ферменты дают аминокислоты, ферменты обладают высокой специфичностью.

Источник