Гост 25581 91 грипп птиц

Содержание

ГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа.
Гост 25581 91 грипп птиц
1. ОТБОР ПРОБ
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа.

Функция доступна в рамках тарифа «Старт+». Приобретите подписку на 1 месяц и пользуйтесь сервисом без ограничений. Подробнее.

Скачать документ

Добавление закладки

Поделиться ссылкой

Добавление в избранное

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ, СИНАНТРОПНАЯ, ДИКАЯ И ЭКЗОТИЧЕСКАЯ

Методы лабораторной диагностики гриппа

Birds, poultry, synanthropos, game and exotic.

Methods of Avian Influenza laboratory diagnostics

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Московской ветеринарной академией им. К.И.Скрябина и Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов

Н.Г.Осидзе, д-р биол. наук; В.И.Смоленский, канд. вет. наук

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 30.09.91 N 1575

3. Срок проверки — 1996 г., периодичность проверок — 5 лет

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

Настоящий стандарт распространяется на сельскохозяйственную, синантропную, дикую и экзотическую птицу и устанавливает методы лабораторной диагностики гриппа.

1.1. Для проведения исследований отбирают пробы патологического материала:

головной мозг и селезенку или гортанные и клоакальные смывы от больной птицы в первые два дня заболевания или от птицы в агональном состоянии. Патологический материал помещают в термос со льдом или раствор глицерина с массовой долей 50%, приготовленный на физиологическом растворе с рН 7,2-7,4;

1.2. Пробы крови для определения антител в сыворотке берут стерильно из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или термостате при 37 °С в течение 1-2 ч, затем осторожно обводят иглой или пастеровской пипеткой по стенке пробирки и оставляют на 16-18 ч при температуре 2-4 °С. Образовавшуюся прозрачную без гемолиза сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные пробирки.

Для ретроспективной диагностики используют парные пробы сывороток крови, полученные от больных и подозреваемых в заболевании птиц в начале заболевания и через 4-10 сут.

1.3. Пробы патологического материала и сывороток крови доставляют в лабораторию в термосе со льдом. К пробам прилагают сопроводительный документ, содержащий сведения о клинике, эпизоотологии заболевания, а также данные о результатах вскрытия трупов.

1.4. До начала лабораторного исследования патологический материал хранят в рефрижераторе при температуре 2-4 °С не более 24 ч.

1.5. Сыворотку крови исследуют в течение 3 сут со дня взятия крови. В случае исследования сыворотки в более поздние сроки ее замораживают или консервируют путем добавления мертиолата натрия до концентрации 1:10000.

2.1. Метод выделения вируса

Сущность метода заключается в выделении вируса на эмбрионах кур и последующей его идентификации.

2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат с температурой нагрева 37-38 °С.

Весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,1 г.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233, раствор с массовой долей 0,8% или другие дезинфицирующие средства.

Натрий лимонно-кислый 3-х замещенный по ГОСТ 22280, раствор с массовой долей 5%.

Йод по ГОСТ 4159, раствор с массовой долей 5% на физиологическом растворе.

Антибиотики — пенициллин и стрептомицин.

Среды питательные МПБ и МПА.

Развивающиеся эмбрионы кур 9-10-суточного возраста.

Эритроциты кур на физиологическом растворе, 0,7 и 1%-ная взвесь, которую готовят следующим образом: кровь берут у петухов или кур в возрасте старше 6 мес из подкрыльцовой вены в колбу с физиологическим раствором в равных объемах с раствором лимонно-кислого натрия.

Полученную кровь трижды отмывают физиологическим раствором, осаждая эритроциты центрифугированием с частотой вращения 1500

в течение 10 мин. Из осадка эритроцитов готовят 0,7 или 1%-ную суспензию на физиологическом растворе и хранят не более 5 сут при температуре 4 °С.

2.1.2. Подготовка к исследованию

2.1.2.1. Обработка органов патологического материала

Патологический материал стерильно извлекают из глицеринового раствора, трехкратно ополаскивают стерильным физиологическим раствором и гомогенизируют с помощью размельчителя тканей или размельчают в ступке с кварцевым стеклом. Гомогенат разводят 1:10 стерильным физиологическим раствором и центрифугируют с частотой вращения 1500-2000

2.1.3. Проведение исследования

Для исследования одной пробы материала (надосадочная 10%-ная суспензия) заражают не менее 10 эмбрионов. Перед заражением эмбрионы предварительно овоскопируют, отмечая границу пуги и участок между кровеносными сосудами для прокола скорлупы и инокуляции исследуемого материала. Скорлупу со стороны пуги и место прокола дезинфицируют раствором йода и фламбируют. В центре воздушного пространства и в месте введения исследуемого материала делают пробойником отверстия, затем через боковое отверстие вводят 0,2 см

исследуемого материала на глубину 2-3 мм в аллантоисную полость. Одновременно делают его высевы по 0,2 см

на питательные среды МПБ и МПА, которые помещают в термостат при 37-38 °С. Контролем служат 5 незараженных эмбрионов. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заливают парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубируют в термостате в течение 24-96 ч при температуре 37-38 °С и относительной влажности 60-70%. В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют два раза в сутки, погибшие — сохраняют в холодильнике при 4 °С. Через 96 ч инкубации все эмбрионы вскрывают после предварительного охлаждения в холодильнике при 4 °С в течение 10-12 ч.

Перед вскрытием эмбрионов скорлупу обрабатывают йодом и фламбируют и из каждого эмбриона отдельно собирают экстраэмбриональную жидкость в стерильные пробирки, которую высевают на МПБ и МПА и проверяют на гемагглютинирующую активность вируса в капельной реакции гемагглютинации (РГА). Реакцию ставят на стекле путем смешивания равных капель экстраэмбриональной жидкости с 1%-ной взвесью эритроцитов кур. При отрицательной РГА образцы экстраэмбриональной жидкости в количестве 1-2 см

от каждого зараженного эмбриона (не менее 5 эмбрионов) объединяют и вновь заражают не менее 10 эмбрионов.

Выделение вируса проводят в течение 3-х пассажей на куриных эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональную жидкость на наличие гемагглютининов в капельной РГА. Если титры гемагглютининов низкие, проводят еще 2-3 дополнительных пассажа.

2.1.4. Обработка результатов

Результат исследования пробы патологического материала считают отрицательным, если в трех дополнительных пассажах не будет обнаружено гемагглютинации эритроцитов.

При наличии гемагглютинации эритроцитов проводят идентификацию выделенного вируса.

2.2. Метод постановки реакции гемагглютинации

Сущность метода заключается в способности вируса гриппа птиц агглютинировать эритроциты кур.

2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы — по п.2.1.1 и дополнительно:

микротитратор типа Такачи или аналогичный;

2.2.2. Проведение исследования

Готовят двукратные разведения вирусосодержащего материала (надосадочную жидкость, полученную после обработки патологического материала, как указано в п.2.1.2.1.) от 1:2 до 1:1024. Для этого в ряд лунок панелей из плексигласа наливают физиологический раствор в объеме 0,2 см

1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

каждого. Реакцию гемагглютинации и реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) ставят также с использованием микротитраторов или микропипеток в объеме 0,025 см

2.2.3. Обработка результатов

Наличие на дне и стенках лунок осадка эритроцитов в виде опрокинутого «зонтика» свидетельствует о положительной РГА. При отрицательной реакции в опыте и контроле эритроциты образуют на дне лунки диск с ровными краями.

Титром вируса считают предельное разведение его, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов, что соответствует одной агглютинирующей единице (1 АЕ).

2.3. Метод идентификации вируса

Сущность метода заключается в способности специфических антител нейтрализовать гемагглютинирующую активность вируса в реакции торможения гемагглютинации со специфическими гриппозными сыворотками.

2.3.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.3.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы — по п.2.2.1 и дополнительно:

набор сухих инактивированных антигенов вируса гриппа тринадцати серологических вариантов и гипериммунных сывороток для диагностики гриппа птиц;

кислота соляная по ГОСТ 3118 с массовой долей 30%.

2.3.2. Проведение исследования

После определения титра исследуемого вируса в количественной РГА по п.2.2.1 ставят РТГА. Вначале устанавливают рабочую дозу вируса (4 АЕ), для чего вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получится от деления на 4 обратного значения гемагглютинирующего титра вируса. Например: если титр вируса 1:256, то рабочее разведение будет 256:4=64, т.е. в 0,2 см

Перед постановкой основного опыта проверяют правильность выбора 4 АЕ. Для этого на панели в четыре лунки наливают по 0,2 см

разведенного вируса удаляют в дезинфицирующий раствор. Таким образом, в первой лунке должно быть 2 АЕ, во второй — 1 АЕ, в третьей — 0,5 АЕ, в четвертой — 0,25 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 см

1%-ной суспензии эритроцитов. Панель встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. При правильном определении рабочей дозы (4 АЕ) в первой и второй лунках должна быть полная агглютинация, в третьей — частичная агглютинация, в четвертой — четко выраженный диск («пуговица») осевших эритроцитов.

Если в третьей лунке оказывается полная агглютинация, то это означает, что выбранная доза вируса содержит не 4 АЕ, а больше. В этом случае доза должна быть уменьшена. И наоборот, отсутствие агглютинации во второй и частично в третьей лунках свидетельствует о недостаточности вируса. Увеличивают или уменьшают рабочую дозу, добавляя соответственно вирус или физиологический раствор и затем повторно проверяют правильность выбора 4 АЕ.

рабочего разведения вируса (4 АЕ). Панели встряхивают и после 30-минутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 см

Для точности учета РТГА ставят контроль:

Источник